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過氧化物酶標記測定細胞凋亡


過氧化物酶標記測定細胞凋亡

本實驗用過氧化物酶標記測定了細胞凋亡。本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養的或從組織中分離的細胞凋亡測定。
實驗原理
脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]在TdT酶的作用下,可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端,與dATP形成異多聚體,并可與連接了報告酶(過氧化物酶或堿性磷酸酶)的抗地高辛抗體結合。在適合底物存在下,過氧化物酶可產生很強的顏色反應,特異準確的定位出正在凋亡的細胞,因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察。
毛地黃植物是地高辛的唯壹來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結合的配體,因而非特異性反應很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動物甾體**的交叉反應不到1%,若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后,則可完全排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用。
主要試劑
1. 磷酸緩沖液PBS(pH7.4):磷酸鈉鹽50mM,NaCl200mM。
2. 蛋白酶K(200μg/ml,pH7.4):蛋白酶K0.02g;PBS100ml。
3. 含2%H2O2的PBS緩沖液(pH7.4):H2O22.0ml;PBS緩沖液98.0ml。
4. TdT酶緩沖液(新鮮配):Trlzma堿3.63g用0.1NHCl調節pH至7.2,加ddH2O定容到1000ml;再加入二甲砷酸鈉29.96g和氯化鈷0.238g。
5. TdT酶反應液:TdT酶32μl;TdT酶緩沖液76μl,混勻,置于冰上備用。
6. 洗滌與終止反應緩沖液:氯化鈉17.4g;檸檬酸鈉8.82g;ddH2O1000ml。
7. 0.05%二氨基聯苯(DAB)溶液:DAB5mg;PBS10ml,pH7.4,臨用前過濾后,加過氧化氫至0.02%。
8. 0.5%甲基綠(pH4.0):甲基綠0.5g;0.1M乙酸鈉100ml。
9. 100%丁醇,100%、95%、90%、80%和70%乙醇,二甲苯,10%中性甲醛溶液,乙酸,松香水等。
10. 過氧化物酶標記的抗地高辛抗體(ONCOR)。
實驗步驟
1. 標本預處理:
   1)石蠟包埋的組織切片預處理:將組織切片置于染色缸中,用二甲苯洗兩次,每次5min。用無水乙醇洗兩次,每次3min。用95%和75%乙醇各洗一次,每次3min。用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液(20ug/ml),于室溫水解15min,去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次,每次2min,然后按下述步驟2進行操作。
   2)冰凍組織切片預處理:將冰凍組織切片置10%中性甲醛中,于室溫固定10min后,去除多余液體。用PBS洗兩次,每次5min。置乙醇:乙酸(2:1)的溶液中,于-20℃處理5min,去除多余液體。用PBS洗兩次,每次5min,然后按下述步驟2進行操作。
   3)培養的或從組織分離的細胞的預處理:將約5×107個/ml細胞于4%中性甲醛室溫中固定10min。在載玻片上滴加50~100μl細胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次,每次5min,然后按下述步驟2進行操作。
2. 色缸中加入含2%過氧化氫的PBS,于室溫反應5min。用PBS洗兩次,每次5min。
3. 用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體,立即在切片上加2滴TdT酶緩沖液,置室溫1~5min。
4. 用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體,立即在切片上滴加54μlTdT酶反應液,置濕盒中于37℃反應1hr(注意:陰性染色對照,加不含TdT酶的反應液)。
5. 將切片置于染色缸中,加入已預熱到37℃的洗滌與終止反應緩沖液,于37℃保溫30min,每10min將載玻片輕輕提起和放下一次,使液體輕微攪動。
6. 組織切片用PBS洗3次,每次5min后,直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體,于濕盒中室溫反應30min。
7. 用PBS洗4次,每次5min。
8. 在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05%DAB溶液,室溫顯色3~6min。
9. 用蒸餾水洗4次,前3次每次1min,*后1次5min。
10. 于室溫用甲基綠進行復染10min。用蒸餾水洗3次,前兩次將載玻片提起放下10次,*后1次靜置30s。依同樣方法再用100%正丁醇洗三次。
11. 用二甲苯脫水3次,每次2min,封片、干燥后,在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果。
注意事項
一定要設立陽性和陰性細胞對照。陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標本,陽性細胞對照可使用地塞米松(1μM)處理3-4hr的大、小鼠胸腺細胞或人外周血**細胞。陰性對照不加TdT酶,其余步驟與實驗組相同。

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